生物顯微鏡的內(nèi)反射熒光技術(shù)原理

　　生物顯微鏡的內(nèi)反射熒光技術(shù)原理
　　生物顯微鏡的內(nèi)反射熒光技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品，使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā)，再用高靈敏度和高時(shí)間分辨率的攝像機(jī)CCD來捕捉熒光并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行顯像，從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品觀測的一種新生技術(shù)。由于消逝波特點(diǎn)及CCD的優(yōu)勢使全內(nèi)反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時(shí)間分辨率，因此它在對單分子的動(dòng)態(tài)觀測具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
　　利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品，使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā)，再用高靈敏度和高時(shí)間分辨率的攝像機(jī)CCD來捕捉熒光并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行顯像，從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品觀測的一種新生技術(shù)。由于消逝波特點(diǎn)及CCD的優(yōu)勢使全內(nèi)反射熒光顯微鏡具有高信噪比和高時(shí)間分辨率，因此它在對單分子的動(dòng)態(tài)觀測具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
　　全內(nèi)反射熒光顯微鏡根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可分為目鏡型和棱鏡型兩種。
　　1.棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡
　　棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡就是利用激光經(jīng)過棱鏡并產(chǎn)生全內(nèi)反射，其消逝波照射已被熒光標(biāo)記的生物樣品，其激發(fā)光從另一側(cè)進(jìn)入目鏡，并被CCD相機(jī)捕捉，其光路圖如圖所示。
　　從光路圖我們可以看出，棱鏡型系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)上更加容易,它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡，它也不容易受到入射光信號(hào)的干擾，但由于消逝波在z軸方向上呈指數(shù)衰減，只能照射100nm的距離。在探測上，放置樣品的空間收到棱鏡的限制。另外由于目鏡和物鏡同樣品距離近，因此同其他儀器的配合也受到限制。目前棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡的發(fā)展很慢，在科學(xué)研究中一般很少用到。
　　2.物鏡型全內(nèi)反射顯微鏡
　　在物鏡型全內(nèi)反射顯微術(shù)中，顯微鏡的物鏡即作為收集樣品熒光信號(hào)的接收器，同時(shí)又作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件，如圖所示。
　　由于細(xì)胞的典型折射率為1.33～1.38 ，因此要想實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射，物鏡的NA必須大于1.38。表達(dá)式為：
　　NA = nsinθ，nsinθ> nsinθc
　　NA為物鏡的數(shù)值孔徑，n、θ分別為物鏡的折射率(浸沒油)和孔徑角。θc為發(fā)生全反射的臨界角。當(dāng)我們使用NA值為1. 4 的透鏡物鏡時(shí)，只有很小的一部分物鏡孔徑范圍(1.4 -1.38=0.02)可以被利用，這顯然增加了光束校準(zhǔn)的難度，同時(shí)光束的強(qiáng)度也很難提高。如果我們使用NA=1. 65的透鏡物鏡，則有一個(gè)大的多的孔徑范圍(1.65-1.38=0.27)可被利用，即有更多的激發(fā)光強(qiáng)可以用來產(chǎn)生全反射。
　　物鏡型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡在制作要求的技術(shù)很高，它是近年來全內(nèi)反射熒光顯微鏡的發(fā)展方向，由于它的物鏡同收集樣品熒光的儀器在同一側(cè)，這有助于同其他的儀器等的結(jié)合。
　　內(nèi)反射熒光顯微鏡的優(yōu)勢應(yīng)用和發(fā)展展望：
　　全內(nèi)反射熒光顯微鏡里用消逝波作為陽品的激發(fā)光源，并用有著高靈敏度和高時(shí)間分辨率的CCD相機(jī)捕捉樣品熒光，因此具有如下優(yōu)點(diǎn)：
　　1.信噪比高(相對共聚焦顯微鏡);
　　2.分辨率高(相對其他的光學(xué)顯微鏡);
　　3.對生物樣本損傷小(相對電鏡)，可以進(jìn)行活體物質(zhì)的研究和單分子的動(dòng)態(tài)研究。
　　全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)正是憑借其*的優(yōu)勢，它的熒光激發(fā)深度只在～100nm的薄層范圍內(nèi)，從而成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)、單分子動(dòng)力學(xué)的前途的光學(xué)成像技術(shù)。
　　全內(nèi)反射熒光顯微成像法不再采用掃描成像，大大提高了成像速度，可以滿足實(shí)時(shí)成像的要求;另一方面它的圖像解釋相對于近場，干涉顯微成像來說也較簡單。